尊龙凯时人生就博的细胞培养指南

培养条件

气相条件为95%空气和5%二氧化碳，温度保持在37℃。

传代方法

首次传代建议比例为1:2，每两天更换培养液。请同时购买尊龙凯时人生就博培养基，以享受优惠。收到细胞后，待培养至良好状态后用完全培养液灌满瓶口并密封，这是确保细胞运输顺利的最佳方法。

细胞处理步骤

在收到细胞后，先用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以使细胞状态稳定。使用显微镜观察细胞生长情况，并分别在40x、100x和200x倍下拍照保存（每种倍数至少拍一张）。前三天的照片作为重要售后依据，如未提供照片则默认状态良好。

细胞培养步骤

细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，收集完全培养液至离心管中，保留5ml培养基在37℃、5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，并在显微镜下观察。若细胞大部分变圆并脱落，则迅速轻敲培养瓶后加5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以确保完全脱落，然后吸出悬液，并转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟。弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 根据1:2的比例将细胞悬液分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

悬浮细胞传代

悬浮细胞传代步骤如下：

1. 使用半换液法，竖着放置培养瓶在培养箱静置约1小时，轻轻吸去约3ml培养基，然后补充3ml完全培养基。如培养基变色缓慢，可再添加约500ul FBS。传代时，直接补充5ml培养基并分为两个培养瓶。一般传代3次后可以进行离心传代，去除死细胞。
2. 使用离心换液法，收集细胞悬液至离心管中，在1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀，然后将细胞悬液按1:2的比例分入新T25瓶中，添加6-8ml配置好的新完全培养基，确保细胞生长活力，后续传代根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存

当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗一次；接着加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化。轻轻吹打细胞使之脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，加入1ml的尊龙凯时人生就博无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如果后续要转入液氮罐中，需在-80℃冰箱存放24小时以上再转入液氮罐中。

细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶后用75%酒精擦拭外壁，随后将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。弃去上清，加入5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶，放入37℃，5% CO2细胞培养箱中继续培养。第二天更换为新鲜完全培养基进行持续培养。

注意事项

需注意的是，一些细胞在运输过程中可能会掉落，这属于正常现象。如果脱落较多，可将培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养。沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后用5ml完全培养基终止反应，然后再离心，弃上清，加入1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃，5% CO2培养箱中继续培养。