哺乳动物蛋白提取试剂盒组成

本试剂盒包括以下成分：5X Buffer（10ml）、5X NaCl（10ml）、5X SDS（10ml）、5X DOC（10ml）、5X NP-40（10ml）、20X PBS（10ml）、以及Protease inhibitor cocktail（0.5ml）。

保存条件

该试剂盒可在常温下储存，唯一例外是Protease inhibitor cocktail需在-20°C下保存，保质期为24个月。

提取步骤

1. 准备细胞裂解缓冲液

按照5X Buffer、5X NaCl、5X SDS、5X DOC和5X NP-40以1:1:1:1:1（v/v）的比例配制细胞裂解缓冲液。使用1ml的裂解缓冲液可以提取10⁶~10⁷个细胞或5~20mg的组织。在使用前，加入10μl的Protease inhibitor cocktail。

2. 洗涤细胞或组织

尊龙凯时人生就博推荐的洗涤步骤如下：

• a. 对于贴壁细胞：去除细胞中的生长培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞两次，然后加入细胞裂解缓冲液（10⁶~10⁷个cells/ml）。将细胞放入冰袋中，在摇床上孵育30分钟，并间歇性重悬细胞，最后收集裂解液。
• b. 对于悬浮细胞：在700xg下离心5分钟，去除上清液。用PBS重悬细胞，洗涤两次，在4°C下离心去除上清液。将沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中（10⁶~10⁷个cells/ml），置于冰袋中，孵育30分钟。
• c. 对于组织：将组织切成小块并用PBS冲洗两次。加入细胞裂解缓冲液（5~20mg组织/ml），并将样品转移至预冷的微量匀浆器中，在冰上均匀化组织30~50次，注意均质过程对靶蛋白的功能完整性至关重要。

3. 离心沉淀

在4°C下，以12,000xg离心裂解的细胞10分钟，沉淀细胞碎片。可进一步以100,000xg超高速离心45分钟以制备蛋白质溶液。

4. 收集上清液

将含有蛋白质的上清液转移至冷冻管中，可以在冰上保存以便立即使用，或者将其保存在-70°C以备后续分析。