当生物医疗研究人员讨论他们宝贵的RNA样品时，我们常常听到“请把那根试管放在冰上！！”和“我希望它不会降解”的声音。RNA的稳定性本质上不及分子生物学研究中使用的大多数大分子（例如DNA或蛋白质）。因此，CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（通常被称为“gRNA”）也面临着被降解的风险。

为了解决这一问题，目前有研究表明，通过化学修饰gRNA，可以显著提高其抗降解能力，同时仍能有效导引Cas9进行靶向切割。这些gRNA技术的进步不仅增强了靶向效果，还减轻了对RNA稳定性的不必要担忧。一些gRNA修饰不仅提升了稳定性，还增加了功能“颜色”或改变了“开关”机制。

稳定的gRNA修饰包括针对CRISPR/Cas9靶向识别序列的磷酸糖骨架修饰，通常由大约20个核苷酸的gRNA引导，该gRNA是较大CRISPR RNA（crRNA）的一部分。除了这段20nt的向导序列外，crRNA的3'末端还包括一个大约20nt的重复区，该区域与Cas9蛋白相互作用的转录激活RNA（tracrRNA）相关。这些RNA分子容易遭到细胞质和核酸酶的攻击，因为它们被识别为外源RNA。为了保护RNA不被降解，目前有几种简单的方法可用于修饰RNA骨架的糖或磷酸分子，以提高稳定性。

自然界早已进化出防止重要细胞RNA通过翻译后修饰降解的方法。其中最常见的是2'-O-甲基化，该过程将甲基添加到核糖的2'羟基上，以保护RNA免受降解。在同一位置，另一种稳定的修饰则是2'-氟（2'-F），它用氟取代2'位置的羟基。此外，3'-硫代磷酸酯键也在糖环中的一个位置替代了非桥接的磷酸氧。其他有用的骨架修饰还包括酰胺键和锁定核酸。

那么，哪种RNA骨架修饰最为有效呢？研究表明，将几种稳定修饰结合使用，例如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰的组合，常常比单独使用单一修饰更为稳定。这些修饰可以通过市售试剂盒在实验室中轻松完成，或者在购买gRNA时作为合成修饰进行订购。修饰通常加入到crRNA分子的末端（通常对前3nt中的1-3个进行修饰），以实现最佳稳定性和有效性。

而在提升gRNA效率时，一种简单的办法是将部分核糖核苷酸替换为脱氧核苷酸。含有部分DNA的gRNA对于Cas9蛋白的耐受性出奇地好，并且能有效提升靶向效率。同时，将锁定的核酸或桥接的核酸纳入gRNA中，可以导致RNA构象的限制，从而提高错配鉴别能力并增强对核酸酶的抵抗力，进而减少脱靶事件。尽管这两者具有类似的优点，但带有N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率更高且毒性较低。

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