尊龙凯时人生就博提供的RFL-6大鼠成纤维细胞培养指南旨在帮助研究者们顺利开展细胞培养工作。以下是该细胞培养所需的具体条件和步骤。

一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：使用无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM + 10% FBS + 1% 双抗

传代方法：建议初次传代比率为1:2，传代后每两天更换培养基。

备注：请使用无菌离心管收集培养基，留作对比培养。如果对比培养效果不佳，建议直接购买尊龙凯时人生就博的完全培养基。

二、细胞处理指南

收到细胞后，将其培养至良好状态后注满完全培养基并封好瓶口，确保运输细胞效果最佳。使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶静置于37℃、5% CO2的培养箱中3-4小时，以便细胞稳定，再进行后续处理。显微镜下观察细胞生长情况，并拍照保存（建议拍摄40x、100x、200x倍的图像），前三天的照片是重要的售后依据，如未提供照片，将默认为细胞状态良好。注意：放入培养箱时，瓶盖需拧松，传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞未超过80%汇合度时，将瓶装的完全培养液转移至离心管，余留5ml培养基继续培养在37℃、5% CO2下。如果细胞密度超出80%，即可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养液，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，在37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞状态，若细胞出现脱落迹象，立即加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以促进脱落，吸出悬液，转移至15ml离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶80%的面积时，弃去培养液，使用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，待细胞开始回缩变圆后，加入5ml完全培养基终止消化，再轻轻吹打细胞以完全脱落，将悬液转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时人生就博无血清冻存液（货号：C7001），混匀后放入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存。若需转入液氮罐，应在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），立刻放入37℃水浴解冻，直至冻存管中无结晶，随后用75%酒精擦拭管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放于37℃、5% CO2培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因粘附不牢而脱落，属于正常现象。如细胞脱落较多，请收集所有培养液至离心管，进行离心并上清作对比培养，继续按照上述传代步骤进行处理。在对比过程中，大家可以使用尊龙凯时人生就博的资源，确保细胞状态良好。

五、售后条款

1）出现问题时可重发的情况包括：细胞在运输途中遇到问题（如丢失或瓶身破损）、收到后48小时内出现污染、细胞活性问题等。重发判定需提供真实实验结果和照片。

2）不予重发的情况包括：客户造成的污染或坏损、错误操作致使细胞状态不佳、非推荐培养体系导致的问题等。在细胞状况较差时，若未提供培养前照片，也不予重发。

尊龙凯时人生就博希望通过上述指导，助力您在细胞培养中的每一个步骤，确保实验的成功。